USO DE ANAVENENOS OFÍDICOS EN EL TRATAMIENTO DE TUMORES EN ANIMALES DOMÉSTICOS
Autores: Gould, Eduardo G.; Amantini, Eduardo O. y Troiano, Juan Carlos

La utilización de venenos de ofidios en el tratamiento de las enfermedades crónicas se conoce desde hace mucho tiempo y sus distintas aplicaciones figuran en farmacopeas que datan de varios siglos. Se denomina anaveneno a los venenos detoxificados de origen animal (arañas, sapos, serpientes, insectos, peces). Una vez obtenidos, los anavenenos conservan fracciones del veneno nativo, por lo general proteínas con actividad enzimática que resisten la desnaturalización del proceso. La mayoría de esas enzimas son fosfolipasas del tipo A2 (PLA2) con propiedades hemolíticas, proteolíticas, citolíticas y con capacidad de unirse a factores de crecimiento presentes en las membranas de células tumorales. Su acción provoca la lisis de esas membranas con la consiguiente muerte celular.
El objetivo del trabajo resume la experiencia utilizando anavenenos ofídicos en el tratamiento de tumores de caninos y felinos domésticos.
Se trabajó con anavenenos producidos por la Fundación de Estudios Biológicos, que básicamente consisten en venenos desnaturalizados en base de diferentes temperaturas y la preparación final estéril a una concentración aproximada inicial de 1 mg/ml. Se utilizaron anavenenos, monovalente (bothrópico) y bivalente (bothrópico-crotálico). Se seleccionaron animales afectados por diferentes tumores, que no recibían tratamiento alguno al momento de iniciar las aplicaciones. Se trataron 50 animales; 18 felinos (32%) y 32 caninos (68%) de diferentes razas y sexos.
Se comenzó con una inyección diaria de 0.25 cc por vía subcutánea de anaveneno bivalente por 5 días, para continuar luego con una dosis de 0.50 cc por la misma vía cada 48 hs. Se trataron 20 casos de tumores de mama (adenocarcinomas lobulillares y carcinomas sólidos con metástasis), 20 casos de carcinomas de células escamosas felino, 5 casos de osteosarcoma canino y 5 casos de linfoma canino.
El 30 % de los casos de carcinoma de células escamosas permanece vivo al cabo de tres años de tratamiento. Los casos de tumores mamarios mostraron una buena evolución con detención del crecimiento tumoral, reducción del tamaño y la desaparición de la sintomatología respiratoria (en casos de metástasis pulmonares) en 80% de los casos. Los casos tratados de linfoma y osteosarcoma canino no respondieron adecuadamente. En el primer caso sólo se observó una sobrevida de 8 meses, con disminución de ganglios superficiales y una mejoría del estado general del animal. En dos casos de osteosarcoma se continúa el tratamiento hasta la fecha y se ha observado una reducción o detención del creciminto del tumor.
Dado que el uso de anavenenos no provoca efectos colaterales asociados a la administración de drogas oncológicas o radioterapia, sumado a la simplicidad de su manejo en cuanto a las vías de administración, hace a los anavenenos una posibilidad terapéutica para el tratamiento de tumores considerados inoperables como algunos carcinomas de células escamosas. Si bien los casos tratados no son abundantes y muestran un éxito dispar, los resultados obtenidos son alentadores y permiten suponer que los anavenenos ofídicos pueden constituir una herramienta terapéutica más y una importante alternativa en el tratamiento de algunos tipos de tumores que afectan a los animales domésticos.




 

ALTERACIONES HEMATOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS PROVOCADAS POR EL USO DE ANAVENENOS OFÍDICOS EN CANINOS Y FELINOS DOMÉSTICOS

Autores: Gould, Eduardo.G.; Amantini, Eduardo O. y Troiano, Juan C.

INTRODUCCIÓN
La utilización de venenos de ofidios en el tratamiento de las enfermedades crónicas se conoce desde hace mucho tiempo y sus distintas aplicaciones figuran en farmacopeas que datan de varios siglos. El empleo de los llamados anavenenos es una de las alternativas terapéuticas basadas en el uso de venenos animales para el tratamiento de diferentes enfermedades crónicas, que van desde la reducción del dolor hasta el tratamiento del cáncer. Se denomina anaveneno a los venenos detoxificados de origen animal (arañas, sapos, serpientes, insectos, peces. Los anavenenos, una vez obtenidos, conservan fracciones del veneno nativo, por lo general proteínas con actividad enzimática que resisten la desnaturalización del proceso. La mayoría de esas enzimas son fosfolipasas del tipo A2 (PLA2) con propiedades hemolíticas, proteolíticas, citolíticas y con capacidad de unirse a factores de crecimiento presentes en las membranas de células tumorales. Su acción provoca la lisis de las membranas celulares con muerte celular.
El objetivo del presente trabajo consiste en describir las posibles alteraciones a nivel hematológico y de bioquímica sanguínea debida al uso de anavenenos en caninos y felinos domésticos.

MATERIALES Y METODOS
Cuarenta caninos y veinte felinos domésticos de diferentes razas, edades y de ambos sexos, afectados por tumores de diferente tipo fueron tratados con anavenenos ofídicos.
Se utilizaron anavenenos producidos por la Fundación de Estudios Biológicos. Estos preparados consisten en Anaveneno Monovalente Bothrópico, Anaveneno Monovalente Crotálico; Anaveneno Bivalente Bothrópico-Crotálico y Anaveneno de Cobra (Naja naja atra). Cada anaveneno posee una concentración inicial de  1 mg/ml de sustancia activa, testado por medio de la técnica de LOWRY.
Se inyectaron animales con dosis crecientes desde 0.25 mg (dosis total) hasta de 4 mg dosis total por vía parenteral cada 24 hs.
Se procedió a tomar muestras de sangre venosa (3 cc por animal) por punción en la vena cefálica antebraquial con material estéril. Dicha muestra se separó en dos. Una de ellas de 1 cc en tubos de vidrio, con tapón de goma, conteniendo heparina como anticoagulante (20 ml/ml de sangre) para estudios hematológicos. La sangre restante fue colocada en tubos de vidrio sin anticoagulante a los fines de obtener suero para las determinaciones bioquímicas. Las determinaciones que se realizaron fueron: recuentos de glóbulos rojos, leucocitos y trombocitos por medio de una dilución 1:200 en pipetas para recuento de glóbulos rojos y blancos y recuento en la cámara de Neubauer. El hematocrito se determinó por el método del microhematocrito y la concentración de hemoglobina fue medida mezclando 20 µl de sangre entera en 50 ml de reactivo de Drabkin (Wiener Laboratorios, Argentina). Después de la centrifugación se midió espectrofotométricamente la concentración de cianmethemoglobina a una absorbencia de  540 nm comparándola con una solución estándar de 15.5 g/dL de hemoglobina (Wiener Laboratorios, Argentina). Los índices hematimétricos (VCM, HCM y CHCM) se calcularon con las formulas de Wintrobe. El recuento diferencial de leucocitos se realizo sobre frotis hechos en el momento de tomar la muestra, secados al aire y teñidos por la técnica pancromática de May-Grünwald &Giemsa.
En las muestras de suero se realizaron las siguientes determinaciones; concentración de proteínas totales, albúminas y globulinas por la técnica del Biuret; la concentración de ácido úrico se determinó en una muestra desproteinizada con ácido tungstico y carbonato de calcio lo cual resulta en un pigmento llamado quinoneimina. La creatinina se determinó usando el método de picrato de creatinina; la urea por medio de la formación de azul de indofenol a 505 nm. Los triglicéridos y la glucosa se midieron a una absorbancia de 505 nm por formación de quinoneina. El colesterol por medio de la reacción de 4p-benzoquinona monofenazona. Los lípidos totales medidos a 530 nm por la reacción de etil-vainillina. La alanino-aminotransferasa (A.L.T.) y aspartato-aminotransferasa (A.S.T.) se determinaron espectrofotométricamente por la formación de 2.4 dinitrofenylfosfato. La fosfatasa alcalina sérica (F.A.S.) se determinó por la hidrólisis de nitrofenylfosfato. La concentración de creatinin-fosfoquinasa (C.P.K.) se determino por el método de Fiske -Subarow, el valor de láctico deshidrogenasa (L.D.H.) fue determinado por medio de la lectura espectrofotométrica de la reacción lactato más NAD y concentración de gamma glutamil - transpeptidasa (GGT) por método colorimétrico cinético de 5-amino.2-nitrobenzoato.
El fósforo se midió a 630 nm por la formación de fosfomolibdato; el calcio se midió a 570 nm por una reacción con cresolphtaleína-complexona. La concentración de cloro se midió a 460 nm midiendo la formación de un complejo con sulfocianato y el magnesio por la detección a 520 nm de magon. El potasio y el sodio se midieron por espectrofotometría de llama. Todos los reactivos fueron provistos por Wiener Laboratorios, Argentina y los valores hallados se expresan en el Sistema Internacional de Medidas (SI Units).

RESULTADOS
No se encontraron alteraciones significativas de los parámetros hematológicos en los pacientes tratados relacionados con la dosis. A la dosis de 2 mg totales no fue posible establecer ningún tipo de desorden relacionado con los glóbulos rojos (anemia, policitemia) ni alteraciones en los valores de hemoglobina o hematocrito. Tampoco se vieron afectados los valores totales de leucocitos y de plaquetas.
En cuanto a las variaciones observadas en el recuento diferencial de leucocitos, solo fue posible observar una eosinofilia del 5 - 10% durante las primeras tres semanas de tratamiento en diez pacientes caninos y tres pacientes felinos. En el 80% de los pacientes tratados se observó la aparición de neutrófilos con las llamadas “granulaciones tóxicas” las cuales desaparecieron al cabo de un mes de tratamiento.
A nivel bioquímico se observó un aumento transitorio de A.S.T. y C.P.K. en 30 % de los pacientes caninos y 40% de los felinos
No se observaron cambios en la concentración de proteínas totales, albúminas, globulinas, urea, creatinina, triglicéridos, lípidos totales, colesterol, glucosa, ácido úrico, calcio, fósforo, magnesio, L.D.H., G.G.T., A.L.T. y F.A.S.

CONCLUSIONES Y DISCUSION
Los estudios de laboratorio realizados sobre los animales tratados indican claramente que el uso de anavenenos en el tratamiento de tumores en algunos animales domésticos no provoca alteraciones y muestra la ausencia de efectos significativos sobre los componentes hematológicos, si bien las citas bibliográficas consultadas demuestran la existencia de una acción patológica de los venenos ofídicos sobre los componentes sanguíneos.
El componente principal de los anavenenos esta constituido por enzimas del tipo PLA2, las cuales poseen varios efectos biológicos tales como provocar hemólisis, efecto anticoagulante, inhibidor o activador de la adhesión plaquetaria, etc.
Los efectos patológicos debidos a la presencia de fracciones del veneno o a la acción de venenos enteros incluyen alteraciones a nivel de coagulación con defibrinogenación o fibrinolisis con retardo en la coagulación, llegando en algunos casos al síndrome de coagulación intravascular diseminada. Estos efectos se han observado con la inoculación experimental o el envenenamiento natural causado por los venenos de los representantes del genero Bothrops y otros crotálidos de América y Asia (géneros Agkistrodon y Trimeresurus, Rosenfeld, 1963)
Los componentes enzimáticos causantes de este efecto son factores llamados “Trombin-like” o activadores de la trombina presentes en los venenos de B. jararaca, B. alternatus y B. atrox. También actúan como activadores de los factores X y II de la cascada de la coagulación así como inhibiendo la protrombina (Gutiérrez y Chávez, 1980; Chang et al, 1970; Evans et al, 1998; Santoro et al, 1993). El mecanismo de acción se basa en interferir la activación y formación del complejo protrombina necesario para el proceso de coagulación.
Otras enzimas de los venenos ofídicos como nucleotidasa, L-aminoxidasa, además de fosfolipasa A2 (PLA2) causan otros efectos sobre el sistema sanguíneo como inducción y/o inhibición de agregación plaquetaria por acción directa o indirecta (Kaiser et al., 1986; Kini, 1997).
Se ha descrito el fenómeno de hemólisis asociado a la acción de venenos enteros o sus fracciones, debido a una alteración de los fosfolípidos de la membrana del eritrocito y su transformación en lisolecitina (Rosenfeld et al, 1962; Scott, 1997). En nuestra experiencia no ha sido posible observar ningún tipo de hemólisis asociada al uso de anavenenos.
Todas estas enzimas se encuentran presentes en los venenos de Bothrops, Crotalus y Elápidos utilizados para lograr sus correspondientes anavenenos. Dada la técnica de obtención de los mismos, estas enzimas se destruyen e inactivan durante el proceso y no causan todos estos efectos descritos anteriormente.
En cuanto a la eosinofilia observada en los pacientes tratados, este hecho ha sido descrito por varios autores en ratas, ratones y perros y se debería a un fenómeno causado por sensibilización (Okamoto et al, 1993)
El aumento de neutrófilos con granulaciones tóxicas también ha sido descrito por otros autores asociados al uso de fracciones de veneno derivadas de crotálidos sudamericanos (de Tolla et al, 1995).
En algunos pacientes se observó un aumento transitorio de los niveles séricos de CPK y LDH, especialmente en aquellos bajo tratamiento con anaveneno bivalente Bothrópico-Crotálico. Probablemente se debió a la presencia de fracciones de veneno incompletamente desnaturalizadas.
En casos de envenenamiento natural o experimental por crotálidos del género Bothrops, que cursan con intensa rhabdomiolisis y mionecrosis, se ha encontrado un aumento de los valores séricos de CPK debido a la presencia de PLA2 miotóxicas llamadas Miotoxinas I, II y III o desintegrinas. En estos casos también se mencionan como hallazgos los aumentos notables de la concentración de LDH y aumento de los valores séricos de urea y creatinina, los cuales no se observaron con el uso de anavenenos. También se describe un aumento de CPK en pacientes tratados con crotoxina, debido quizás al efecto miolítico de la toxina de Crotalus durissus terrificus (Breiphaut, 1976; Gopalokrishnakone, et al, 1984; Gutiérrez et al, 1997; Kouyoumedjian et al, 1986, Mebs et al, 1990).Ninguno de estos hallazgos descritos fueron encontrados en la experiencia con anavenenos.
En resumen, solo fue posible observar un aumento transitorio del porcentaje de eosinófilos, aparición de granulaciones citoplasmáticas en neutrófilos y aumentos transitorios de los valores séricos de CPK y AST con el uso de anavenenos. Esto indica que se trata de un material biológico inocuo, el cual puede ser utilizado con un amplio margen terapéutico en el tratamiento de los tumores que afectan a los animales domésticos, por un largo plazo y sin que se produzcan efectos indeseables asociados al uso de otras drogas antineoplásicas.


REFERENCIAS

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